Dvi-fotonių vyksmų tyrimų padalinys

Kinetinės spektroskopijos padalinys

Nanodarinių sintezės baras

Nuostoviosios spektroskopijos padalinys

Operacinė-manipuliacinė

Optinės mikroskopijos padalinys

Skenuojančio zondo mikroskopijos padalinys

Šviesos ir biologinio objekto sąveikos tyrimų padalinys

Dvi-fotonių vyksmų tyrimų padalinys

Modernioje klinikinėje diagnostikoje vis plačiau naudojami optiniai spektroskopiniai metodai, kurie yra palyginti paprasti, neinvaziniai, bei įgalina operatyviai rinkti bei apdoroti biologinius audinius charakterizuojančią informaciją.

Regimosios šviesos, kuri yra naudojama audinių optinėms savybėms tirti, prasiskverbimą į biologinius audinius riboja endogeninių pigmentų sąlygojama sugertis bei šviesos sklaida audiniuose. Dėl sumažėjusios sklaidos ir biologiniams audiniams būdingo optinio skaidrumo “lango” gilesnius audinių sluoksnius efektyviau pasiekia infraraudonieji spinduliai, tačiau jų energijos nepakanka audinio molekulėms sužadinti. Todėl siekiant užtikrinti selektyvų specifinių endogeninių ar egzogeninių fluoroforų fluorescencijos sužadinimą, o ypač gilesniuose audinių sluoksniuose, galėtų būti naudojamas dvifotonis žadinimas infraraudonaisiais spinduliais.

Dvifotonis fluorescencijos žadinimas pasižymi keletu svarbių ypatybių: pavieniai infraraudonosios spinduliuotės fotonai prasiskverbia pro jiems skaidrų biologinį audinį, nes jų energijos nepakanka aplinkoje esančioms molekulėms sužadinti, tačiau dviejų fotonų, pasiekusių molekulę vienu metu, turimas energijos kiekis yra pakankamas sužadinti biologiniame audinyje esančių molekulių fluorescenciją.

Fokusuojant lazerinę spinduliuotę ir parenkant energinius spinduliuotės parametrus, reikiamą intensyvumą galima užtikrinti nedideliame erdviniame segmente, taip išvengiant fluoroforų suardymo šviesa tyrimų metu. Jei fluorescuojančios molekulės yra selektyviai susikaupusios ieškomo tipo (pvz., navikiniame) audinyje, jo lokalizaciją ir apimtį galima operatyviai nustatyti spektroskopiniais metodais ar optinio vaizdinimo sistemomis.

Įrengtame dvifotonės sensibilizacijos tyrimų stende panaudoti:

• optiniai stalai,
• Ti:safyro lazeris,
• bandinio skenavimo sistema,
• optiniai, mechaniniai mazgai,
• šviesolaidinės sistemos,
• CCD kamera.

Taip pat yra ir visi reikiami optiniai bei mechaniniai mazgai lazerinių šviesos šaltinių spinduliuotei atvesti į kiuvetę, bandinį ar skenavimo sistemą.

Šiame stende galima atlikti įvairių sensibilizatorių dvifotonės sugerties tyrimus, įvertinti dvifotonės sensibilizatorių fluorescencijos sužadinimo skirtingose modelinėse sistemose sąlygas. Tam tiriama dvifotoniškai sužadinta fluorescencija, t.y. jos intensyvumo pasiskirstymas esant įvairioms bandymo sąlygoms: be sklaidančiųjų dalelių modelinėse sistemose ir didėjant sklaidančiosios medžiagos kiekiui jose. Taip pat, galima įvertinti sensibilizatorių fotostabilumą esant dvifotoniam žadinimui. Siekiant įvertinti dvifotonio žadinimo efektyvumą, galima atlikti sensibilizatorių vienfotonės sugerties tyrimus. Tam tiriama sensibilizatorių fluorescencija, sensibilizatorių fotostabilumas žadinant juos vienfotoniškai.

Kinetinės spektroskopijos padalinys

Pastaruoju metu vis plačiau taikomi labai jautrūs optiniai diagnostikos metodai, įgalinantys tyrinėti audinius molekuliniu lygmeniu. Tai neinvaziniai metodai, kuriais diagnostinė informacija gaunama nedelsiant. Plačiausiai biologinių objektų optinėms savybėms bei jų pakitimams tirti naudojamas metodas yra fluorescencinė spektroskopija.

Biologiniam audiniui būdinga savitoji (auto) fluorescencija, kurią sąlygoja jame esantys natūralūs fluoroforai. Daugumos endogeninių fluoroforų fluorescencija yra susijusi su audinių struktūra ir biologiniame objekte vykstančiais metaboliniais vyksmais, todėl savitoji audinių fluorescencija gali parodyti tiek ligos pažeistą audinį, tiek išryškinti audinio morfologinius ar metabolinius specifiškumus, kurie sunkiai nustatomi kitais būdais.

Vienas iš jautriausių bei universaliausių audinių fluorescencinių savybių tyrimo prietaisų yra fluorimetras (su įmontuota pavienių fotonų skaičiavimo sistema). Šiuo prietaisu galima registruoti nuostoviosios fluorescencijos bei fluorescencijos žadinimo spektrus, fluorescencijos gesimo kinetikas, fluorescencijos bei jos kinetikų anizotropijas. Matavimus galima atlikti tiek kiuvetėse, tiek ir tiesiogiai tiriant bandinio paviršių (naudojant kietųjų bandinių laikiklį arba šviesolaidinį zondą).

Šiame stende galima atlikti širdies, navikinių bei kitų audinių (oda, gerklos, šlapimo pūslė, sąnariai ir t.t.) spektrinius tyrimus (fluorescencijos bei fluorescencijos žadinimo matavimus) bei registruoti ypač silpnus fluorescencijos (autofluorescencijos) signalus. Minėtus matavimus galima atlikti tiek ex vivo preparatų (pvz., tirti įvairios morfologijos ir histologijos audinius, sensibilizatorių ir kvantinių taškų susikaupimą įvairiuose organuose), tiek gyvų biologinių objektų (pvz., tirti kvantinių taškų bei sensibilizatorių pasiskirstymą eksperimentinių gyvūnų audiniuose). Fluorescencijai sužadinti galima prijungti Ti:safyro lazerį, lazerinius diodus bei (UV-VIS) švitinimo šaltinį.

Nanodarinių sintezės baras

Nanodarinių sintezės bare yra  įrengtos trys darbo vietos:

• Darbo vieta skirta įvairių nanodarinių sintezei ir jų paviršiaus modifikavimui. Darbo vietoje galima atlikti eksperimentus su toksiškomis medžiagomis.
• Darbo vieta skirta medžiagų tirpinimui, įvairių tirpalų ruošimui bei skiedimui.
• Darbo vieta skirta itin tiksliam medžiagų svėrimui.

Laboratorijoje atliekama įvairių fluoroforų (sensibilizatorių, nanodalelių, organinių žymeklių) nuostoviosios sugerties ir fluorescencinė spektroskopija. Tiriamos šių medžiagų optinės savybės įvairiose aplinkose, priklausomai nuo tirpiklio, jo pH, tirpalo komponentų koncentracijų ir kitų aplinkos parametrų.

FNT procesų tyrimai
Sugerties spektroskopija leidžia tirti fotodinaminės navikų terapijos metu (FNT) vykstančius procesus:

• įvertinti suirusio sensibilizatoriaus kiekį, įvertinti optinių savybių pokyčius, atspindinčius molekulės struktūros pokyčius;
• įvertinti susidariusio fotoprodukto kiekį ir kt. (pav.).

Pav. Sensibilizatoriaus hematoporfirinio spektrinių
savybių pokyčiai priklausomai nuo švitinimo dozės

Šie eksperimentiniai tyrimai yra svarbūs siekiant geriau suprasti FNT metu vykstančius fotocheminius procesus, palyginti skirtingų sensibilizatorių efektyvumą, leidžia prognozuoti ir optimizuoti klinikinę FNT eigą.

Sugerties ir fluorescencinės spektroskopijos metodais taip pat analizuojami ląstelių ir biologinių audinių mėginiai, išpreparuoti iš eksperimentinių gyvūnų, kuriems buvo suleistas fotovaistas. Tokių mėginių analizė suteikia vertingos informacijos apie sensibilizatorių savybių pokyčius gyvame organizme, apie jų susikaupimą, farmokokinetiką ir pasiskirstymą organizme.

Nanodalelių spektroskopija
Laboratorijoje taip pat tiriamos komerciškai prieinamos bei laboratorijoje susintetintos nanodalelės. Daugiausiai dėmesio skiriama kvantiniams taškams, pasižymintiems aukštu fluorescencijos kvantiniu našumu, nuo dalelės dydžio priklausančiu fluorescencijos spektru, fotostabilumu ir kitomis išskirtinėmis optinėmis savybėmis. Spektroskopijos laboratorijoje tiriamas šių dalelių optinės savybės ir jų pokyčiai sąveikaujant su šviesa (fotostabilumas), cheminis stabilumas įvairiuose tirpikliuose, taip pat ir biologiniuose preparatuose (audinių homogenatuose, navikų suspensijose).

Kvantiniai taškai pasižymi tuo, jog jie yra nesunkiai chemiškai modifikuojamas ir funkcionalizuotas, t.y. jų paviršius modifikuojamas taip, kad specifiškai sąveikautų su biologiniu audiniu ar ląstelių kultūra ir atrankiai pažymėtų dominančias ląsteles (pvz., navikines). Šios dalelės taip pat gali būti konjuguojamos su FNT naudojamais sensibilizatoriais. Tokiu būdu išnaudojama stipri kvantinių taškų sugertis ir gali vykti energijos pernaša sensibilizatoriui, t.y. fotoaktyviai molekulei, inicijuojančiai toksinius procesus navike. Yra daugybė kvantinių taškų modifikavimo ir panaudojimo galimybių, tačiau pirminis nanodalelių charakterizavimas yra optinių savybių tyrimai, nes būtent optinės savybės apsprendžia kvantinių taškų panaudojimo efektyvumą.

Pav. Kvantinių taškų spektro priklausomybė
nuo dalelės dydžio ir jų paviršiaus modifikavimo galimybės.

Žymeklių pasiskirstymo tyrimai
Laboratorijoje esantis fluorimetras „Cary Eclipse“ turi lankstų šviesolaidinį priedą, leidžiantį registruoti specifinių bandinių fluorescenciją. Tai mažo tūrio (lašo) mėginiai arba biologinio audinio preparatai ant objektinio stikliuko. Tokių mėginių spektroskopijos negalima atlikti standartinėse kiuvetėse, tačiau jų optinės savybės svarbios tiriant fotožymeklio, sensibilizatoriaus ar nanodalelių susikaupimą ar optinių savybių pokyčius atsirandančius biologiniame audinyje. Šviesolaidinė sistema taip pat padeda neinvaziškai užregistruoti į laboratorinį gyvūną įvesto fluoroforo pasiskirstymą ir farmakokinetiką, netgi nemigdant gyvūno.

Operacinė-manipuliacinė

Operacinėje ir manipuliacinėje atliekami tyrimai su šiais eksperimentiniais gyvūnais:

• Wistar linijos žiurkėmis.

• Pelėmis: BALB/c (baltos), C57BL (juodos), Hibridai (F1) (pilkos).

• Pelės : Erlicho ascitas, Adeno karcinoma LLC, Melanoma B 16, Hepatoma 129.
• Žiurkės: Walker karcinosarkoma, Glioma C6.

• Fotosensibilizuota navikų terapija bei diagnostika, naudojant įvairius fotosensibilizatorius bei fluorescencinius žymeklius.
• Teratogeninio poveikio  žiurkių embrionams, placentinio barjero pralaidumo  fotovaistams ir fluorescenciniams žymekliams tyrimai.
• Fotovaistų ir fluorescencinių žymeklių kaupimosi įvairiuose organuose ir navikuose farmakokinetika bei lokalizacija.
• Laboratorinių gyvūnų organų (smegenų,  plaučių, stemplės, skrandžio, kepenų, inkstų, gimdos, šlapimo pūslės, raumenų ir kt.) bei naviko homogenato  paruošimas fluorescenciniams matavimams.
• Mėginių paruošimas fluorescenciniams ir sugerties spektroskopijos  matavimams. Kraujo  paėmimas iš gyvo  organizmo:
  • Kraujo mėginiai iš gyvo organizmo;
  • Kraujo mėginiai iš negyvo organizmo;
  • Šlapimo mėginių paėmimas.
• Fotovaistų ir fluorescencinių žymelių įvedimas:
  • per OS;
  • intraveninis,
  • į pilvo ertmę,
  • į naviką.
• Navikinių ląstelių palaikymas gyvame organizme ir  užšaldymas skysto azoto diuaruose GT-11.
• FNT vyksmų inicijavimas, naudojant lazerinius bei diodinius šviesos šaltinius.
  • FNT vyksmų inicijavimui yra naudojami lazeriniai bei diodiniai šviesos šaltiniai:
    λ=635 nm; I ≤100 mW/cm2;
    λ=635 nm; I ≤190 mW/cm2;
    λ=650 nm; I ≤400 mW/cm2.

Optinės mikroskopijos padalinys

Skenuojančio zondo mikroskopijos padalinys

Šviesos ir biologinio objekto sąveikos tyrimų padalinys